無細(xì)胞表達(dá)（Cell-Free ex[x]pression, CFE）是一種在體外環(huán)境中合成蛋白質(zhì)的生物技術(shù)。它通過將細(xì)胞內(nèi)用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子組分提取出來，重構(gòu)一個(gè)能夠驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)合成的反應(yīng)體系。該技術(shù)不依賴活細(xì)胞，因而具備高度開放性和可控性，為基礎(chǔ)研究和合成生物學(xué)提供了靈活而高效的工具。

一、無細(xì)胞表達(dá)的原理

無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通過從生物細(xì)胞中提取細(xì)胞裂解物（含有核糖體、tRNA、轉(zhuǎn)錄因子、酶等），并加入核苷酸、氨基酸、能量再生系統(tǒng)和DNA或mRNA模板，在體外完成轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。

蛋白質(zhì)的合成分兩個(gè)階段進(jìn)行：

轉(zhuǎn)錄（Transc[x]ription）：DNA模板在RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA。

翻譯（Translation）：mRNA在核糖體上被翻譯為蛋白質(zhì)鏈，隨后折疊為具有功能的蛋白分子。

由于無需細(xì)胞生長和繁殖，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，體系中組分明確，便于調(diào)控與干預(yù)。

二、主要無細(xì)胞表達(dá)體系簡介

目前常用的無細(xì)胞表達(dá)體系多來源于不同生物物種的細(xì)胞裂解物或重組蛋白系統(tǒng)。常見體系包括：

E. coli 體系：基于大腸桿菌裂解液構(gòu)建，反應(yīng)效率高，廣泛用于基礎(chǔ)研究和技術(shù)開發(fā)。

小麥胚芽體系：源自植物細(xì)胞，更適合表達(dá)真核蛋白，特別是結(jié)構(gòu)復(fù)雜或含有二硫鍵的蛋白質(zhì)。

兔網(wǎng)織紅細(xì)胞體系：具有良好的翻譯能力，可表達(dá)多種哺乳動(dòng)物蛋白，適用于功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

CHO體系：提供接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯環(huán)境，支持糖基化等翻譯后修飾。

PURE體系：由純化的蛋白質(zhì)和rRNA等組分組裝而成，成分高度可控，適合機(jī)制研究和合成生物學(xué)。

三、模板類型與表達(dá)策略

無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可使用多種模板類型，包括：

環(huán)狀質(zhì)粒DNA：傳統(tǒng)的表達(dá)模板，穩(wěn)定性高。

線性DNA片段：由PCR或合成獲得，無需克隆步驟，可直接使用，適合快速構(gòu)建表達(dá)體系。

體外轉(zhuǎn)錄的mRNA：用于僅需翻譯過程的表達(dá)系統(tǒng)，避開DNA污染風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可設(shè)計(jì)融合標(biāo)簽（如His-tag、FLAG-tag）以便于純化與檢測，也可加入調(diào)控元件以控制表達(dá)水平。

四、表達(dá)產(chǎn)物與評(píng)估方式

無細(xì)胞體系的產(chǎn)物可為可溶蛋白、包涵體或膜蛋白，具體形式取決于蛋白本身特性與體系條件。常用的表達(dá)評(píng)估方式包括：

SDS-PAGE 與 Coomassie 染色

Western blot 檢測特異性表達(dá)

功能檢測（酶活、結(jié)合實(shí)驗(yàn)）

蛋白定量分析（BCA, Bradford 等）

此外，加入輔因子、折疊輔助因子或脂質(zhì)體，可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)功能性或適配膜蛋白表達(dá)。

無細(xì)胞蛋白合成技術(shù)已從早期的基礎(chǔ)研究平臺(tái)發(fā)展為具備可擴(kuò)展性的合成平臺(tái)。它被廣泛用于研究轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白折疊調(diào)控等問題。近年來，隨著系統(tǒng)合成優(yōu)化和模塊化設(shè)計(jì)的發(fā)展，無細(xì)胞表達(dá)逐漸成為蛋白工程、RNA合成和人工細(xì)胞構(gòu)建等領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)技術(shù)。

相比傳統(tǒng)表達(dá)方式，無細(xì)胞系統(tǒng)更開放、更可控，更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化與高通量組合實(shí)驗(yàn)，是推動(dòng)合成生物學(xué)與生物制造革新的關(guān)鍵工具之一。

常見問題 FAQ

Q1：無細(xì)胞蛋白表達(dá)與傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)有什么不同？A： 無細(xì)胞表達(dá)不依賴活細(xì)胞增殖，直接在體外體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。它更快速、可控，尤其適用于毒性蛋白、高通量篩選和快速原型開發(fā)等場景。

Q2：線性DNA和質(zhì)粒在無細(xì)胞系統(tǒng)中都能用嗎？A： 大多數(shù)無細(xì)胞體系支持線性DNA表達(dá)，尤其適合快速構(gòu)建篩選。質(zhì)粒表達(dá)更穩(wěn)定，適用于長期反應(yīng)或大規(guī)模合成。

Q3：無細(xì)胞體系可以表達(dá)真核蛋白嗎？A： 使用來源于哺乳動(dòng)物、昆蟲或植物細(xì)胞的裂解液（如CHO、小麥胚芽體系）可高效表達(dá)真核蛋白，部分體系還能進(jìn)行糖基化等翻譯后修飾。

Q4：無細(xì)胞平臺(tái)能否表達(dá)膜蛋白或毒性蛋白？A： 無細(xì)胞系統(tǒng)提供安全、可控的表達(dá)環(huán)境，是表達(dá)膜蛋白和毒性蛋白的有效替代方案。

Q5：無細(xì)胞表達(dá)的蛋白功能完整嗎？A： 多數(shù)目標(biāo)蛋白通過體系優(yōu)化后可獲得良好折疊和功能活性，尤其在真核體系中表現(xiàn)更佳。

Q6：是否支持mRNA直接翻譯？A： 部分無細(xì)胞體系支持mRNA模板翻譯，常用于疫苗研發(fā)、體外合成研究等領(lǐng)域。

Q7：一個(gè)無細(xì)胞表達(dá)反應(yīng)一般多長時(shí)間？A： 快4-6小時(shí)內(nèi)即可完成整個(gè)流程，大幅縮短實(shí)驗(yàn)周期。